下一代测序(NGS)增加了我们对许多原发性线粒体疾病(PMD)的分子基础的理解。尽管取得了这一进展，但许多疑似PMD的患者仍然没有进行基因诊断，这限制了他们获得深入的遗传咨询、生殖选择和临床试验的机会，此外还阻碍了了解潜在疾病机制的努力。在这篇综述中，讨论了当前的PMD基因检测方法，以及在临床环境中增加使用核和线粒体DNA(mtDNA)全基因组NGS的机会，该文考虑了长读长测序方法在mtDNA测序和PMD新核基因组原因鉴定中的可能作用。论文于年5月发表于NatureReviewNeurology，文章题目为“Applyinggenomicandtranscriptomicadvancestomitochondrialmedicine”。
原发性线粒体疾病(PMD)包括一组罕见的遗传病，其特征是线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)受损，导致能量缺乏和器官功能障碍。这些疾病是通过鉴定已知会导致OXPHOS功能障碍或以另一种方式扰乱线粒体结构和功能的DNA变体来定义的。线粒体和核基因组中的多个基因与PMD相关。其中许多疾病在分子水平上非常罕见，但总体而言，成人PMD的患病率约为4,分之一（16岁以下儿童为11,分之一），使它们成为最常见的遗传性神经系统疾病之一。
线粒体是几乎所有细胞类型代谢的中心枢纽。因此，线粒体功能受损的临床表现可能极其异质，给诊断带来巨大挑战。通常与PMD相关的症状包括精神运动退化、肌张力障碍、发育障碍、骨髓功能障碍、肌肉疲劳、运动不耐受、肌病、眼肌麻痹、偏头痛、脑病和中风样发作、癫痫发作、视神经病变、心肌病和心脏传导缺陷、耳聋和内脏脑病（尤其是糖尿病）（图1）。临床PMD的表现通常是多系统的，尤其是在儿童中。
图1线粒体疾病症状汇总
诊断挑战
与其他神经遗传性疾病相比，PMD的研究提出了独特的挑战（表1）。这些挑战的出现主要是因为线粒体包含自己的基因组，该基因组由线粒体DNA(mtDNA)组成，与核DNA(nDNA)不同。mtDNA是一种短的双链环状分子，长度约为16.6kb。每个线粒体中存在多个mtDNA拷贝，每个细胞的线粒体数量因细胞类型而异。在mtDNA基因中，13个编码线粒体蛋白，24个编码非编码RNA。mtDNA不含大的内含子或基因间序列；相反，大多数蛋白质编码基因被编码转移RNA(tRNA)的基因隔开。
mtDNA仅通过卵子传播，因此与mtDNA相关的PMD是母系遗传的；然而，1,个nDNA基因（从父母双方继承）也编码线粒体功能所需的蛋白质。因此，PMD可由mtDNA或nDNA内的致病性遗传变异引起。事实上，大量且不断增加的nDNA基因已与PMD相关。由于存在大量控制mtDNA维持的核基因亚组，情况进一步复杂化。
核基因的下一代测序(NGS)，主要是靶向基因组和全外显子组测序(WES)，已成为PMD研究的支柱，并导致实现的分子诊断数量大幅增加。该技术以极具竞争力的成本提供准确的测序，现已广泛应用于临床实验室。NGS现在也常规应用于整个线粒体基因组的测序。然而，短读长对于PMD中致病变异的识别和确认具有固有的局限性。这些限制包括难以检测结构变异(SV)和短串联重复变异(STR)，无法对变异进行定相和识别表观遗传修饰，以及缺乏转录数据，所有这些都可能阻碍变异的发现和解释。
表3总结了新兴基因组和转录组学技术的临床应用
新兴分子技术
WES和WGS现在已嵌入临床遗传实验室。相比之下，在诊断环境中整合长读长和RNA测序的相对价值直到最近还不太清楚。然而，鉴于这些技术在解释WES和WGS数据时带来的巨大好处，我们相信它们的应用是不可避免的（表3）。
长读长测序
第三代测序技术可以产生10kb的读取（NGS中使用的短读取长度通常约为bp），从而可以在一次读取中对整个线粒体基因组进行测序。单分子实时(SMRT)测序（PacificBiosciences）和纳米孔测序（OxfordNanoporeTechnologies）目前在长读长测序平台领域处于领先地位（图3）。简而言之，SMRT测序使用长环状DNA分子的合成测序。在合成过程中，通过聚合酶将互补标记的核苷酸一个一个地添加到环化DNA中。每个核苷酸在添加时都会发出特征荧光，并实时记录下来，从而实现测序。这种方法还可以检测表观遗传修饰，因为它们会改变添加核苷酸的时间。
图3Pacbio的SMRT测序技术和ONT的纳米孔测序技术
在纳米孔测序中，单链DNA分子通过一个孔碱基，在电流通过时扰动电流。特定碱基导致当前和表观遗传修饰的特征性改变也是可检测的。与NGS相比，这两种技术都不太准确，产生的数据量更大，并且需要进一步优化用于数据分析的生物信息学工具。因此，它们尚未广泛引入临床实践，但鉴于迄今为止取得的进展，它们很可能在未来应用于诊断环境。
线粒体DNA的长读长测序
mtDNA的长读长测序尚处于起步阶段，但它有可能建立在NGS的基础上，作为mtDNA基因检测的“allinone”解决方案。它将通过线粒体基因组的靶向、无PCR测序和从头组装来识别点突变和大规模重排。
SMRT测序已被用于对来自多种制剂的mtDNA进行测序，即多扩增子PCR、扩增子长程PCR和未扩增的富集mtDNA。后者由PacificBiosciences执行，尚未以同行评审形式发表；然而，这些数据是在年基因组生物学和技术进展会议上公布的，海报的副本可在PacBio网站上找到。根据海报展示，作者在少量DNA(ng)上实现了跨越整个分子的长读长，并成功鉴定了合成的异质变体。然而，他们承认需要进一步优化富集和文库制备以增加长DNA片段的比例。SMRT测序也已用于其他疾病状态，从其编码对应物解析假基因，强调其在分析过程中消除mtDNA核拷贝的潜在效用。
目前已经有许多协议可以使用纳米孔技术对整个线粒体基因组进行测序，无论是否有mtDNA富集步骤。纳米孔方法有望提高mtDNA均聚区域的分辨率，并且工作强度低于NGS方法。在临床空间（用于识别缺失）中使用纳米孔测序的初步尝试产生了有希望的结果。该技术（用于长程PCR扩增DNA）成功识别缺失，与NGS方法。重要的是，在两名患者中，长读长识别了之前短读长测序遗漏的缺失。假阳性率太高，无法识别异质性SNV，而异质性重排的缺失识别生物信息学优化困难；然而，未来的技术发展可能会解决这些问题。
有趣的是，由于整个mtDNA分子在一个步骤中被测序，长读长测序将使异质变体能够解析为特定的分子。此外，虽然线粒体单倍群可以从短读段构建，但长读段可能在未来简化线粒体单倍群指定中发挥作用。
核DNA的长读长测序
第三代测序方法特别有希望用于nDNA测序。来自SMRT和纳米孔技术的长读长能够实现从头组装并解决基因组的挑战性区域。对于临床诊断，这些技术的大部分前景在于它们识别重复扩展和SV的能力，这对短读长的计算要求很高，并且能够在没有亲本样本的情况下对变异进行定相（图4）。
图4长读长测序技术在线粒体医学中的作用和价值
单倍型分型困难
了解变异的亲本起源很重要，特别是对于确定复合杂合突变的致病性。尽管父母样本可用于阶段变异，但由于PMD成人出现较晚，因此通常难以获得此类样本。NGS检测到的读数通常太短，无法将感兴趣的变异与信息位点联系起来，从而指定染色体阶段；然而，长读很可能会克服这个问题。此外，纳米孔长读数最近已被用于将mtDNA的核拷贝解析到其核（染色体）位置，并排除mtDNA父系遗传的可能性。
结构变异
SV的断点通常位于基因组的重复区域内。在这些区域内映射短读段是有问题的——当读段落在非唯一重复区域内时，组装工具很难将它们与特定位点对齐。当同一重复序列的重叠群在一段DNA中重新出现时，通常很难对齐介入的非重复重叠群；因此，对齐或从头组装将受到损害，并且可能会忽略致病性SV。除了影响编码DNA之外，SVs还可以影响基因表达，强调了在临床环境中识别这些变异的重要性，因为它们可能解释无法解决的单基因疾病。尽管NGS和微阵列技术确实可以识别SV，但它们可能会遗漏一些SV，并且NGS拷贝数变异分析会产生大量假阳性。然而，当NGS补充时，长读长技术的使用已被证明可以提高对SV的检测。SV尚未被确定为PMD的原因，但将这些技术引入临床领域可能会对这一发现提出挑战，特别是考虑到大量PMD在WGS后仍未得到基因诊断。
串联重复
使用NGS短读技术识别STR扩展非常具有挑战性。生物信息学工具可以帮助解决这些挑战，但它们尚未在临床实践中得到广泛采用，并且需要进行验证性测试。目前，重复扩增与PMD无关，但鉴于特定PMD实体的稀有性和识别这些突变的难度，这可能并不令人惊讶。可以对重复片段进行测序的长读长测序技术可能会彻底改变STR相关疾病的诊断和基因发现。已经开发了几种使用长读长技术在全基因组基础上鉴定串联重复变异的方法，这些长读长已被用于鉴定已知的致病性STR变异并发现疾病的新串联重复原因。
表观遗传修饰
DNA表观遗传修饰与许多单基因疾病有关，包括印记障碍和一些STR障碍。此外，对于某些情况，例如发育障碍，表观遗传特征可以提供其潜在遗传基础的线索，并可用作功能证据来阐明意义不明的变异。NGS方法无法检测表观遗传修饰，但长读长测序可能提供克服这一问题的机会。mtDNA甲基化的证据混杂并受技术问题的影响。然而，一些研究表明mtDNA甲基化是实质性的，但并不局限于通常的CpG位点。mtRNA的转录后修饰很复杂，但我们对这些变化的理解正在提高。未来，长读长可以提供对mtDNA表观遗传修饰的见解；例如，在包含启动子区域和转录起始位点的非编码D环内。如下所述，表观遗传修饰可能与研究线粒体tRNA分子特别相关，这些分子经历了广泛的、与疾病相关的转录后表观遗传修饰。
结论
遗传学在神经病学中的作用目前正在发生转变。基因组医学已经从以研究为基础的努力发展成为用于诊断基因实验室的成熟且宝贵的工具。基因组测序以前只用于最具挑战性的病例，但越来越多地被用作罕见遗传神经疾病的一线研究。为了实现下一次诊断提升并提高效率，线粒体医学领域的临床医生和研究人员需要接受新的实验室技术和测序技术。精心挑选的PMD患者可能会在诊断过程的早期从WGS中获益。长读长测序测序有可能在识别PMD的新遗传原因、解决定相问题以及通过直接测序改进RNA和mtDNA研究方面提供进展。
参考文献：
Mackenetal.,Applyinggenomicandtranscriptomicadvancestomitochondrialmedicine.NatureReviewNeurology.
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